Метод определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза

В современной неблагоприятной эпидемиологической обстановке по туберкулезу эффективный контроль за лекарственной чувствительностью микобактерий туберкулеза (МВТ) является приоритетной задачей, стоящей перед здравоохранением. Нужно отметить, что используемые в настоящее время традиционные методы бактериологической диагностики туберкулеза имеют ряд недостатков, обусловленных биологическими особенностями возбудителя туберкулеза. Учитывая вышесказанное, разработка новых чувствительных методов бактериологического исследования, позволяющих изучать динамику роста микобактерий в присутствии противотуберкулезных препаратов (ПТП), представляется весьма актуальной проблемой.

Целью работы являлась разработка доступного для применения в лабораторной практике количественного метода определения лекарственной чувствительности МВТ в жидкой питательной среде.

Нами был разработан колориметрический микрометод, основанный на способности живых клеток редуцировать 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ) до пурпурного формазана. В результате проведенных исследований было показано, что МТТ-тест может использоваться для определения количества, жизнеспособности и скорости роста бактерий в жидкой питательной среде. Были определены оптимальные концентрация МТТ в реакционной системе, время инкубации МВТ с МТТ, режим экстрагирования формазана, а также оптимальная исходная концентрация МВТ для оценки динамики роста микобактерий в жидкой питательной среде. В результате эксперимента с серийными 10-кратными разведениями исходной суспензии бактерий с использованием этих параметров была создана калибровочная кривая, позволяющая определять концентрацию клеток микобактерий в исследуемом образце по оптической плотности редуцированного МТТ. Наличие линейной зависимости между оптической плотностью и количеством клеток микобактерий в суспензии в концентрации свыше 10⁶ кл/мл позволило использовать данный метод для оценки количества микобактериальных клеток в эксперименте.

Предлагаемым способом было проведено определение чувствительности 22 штаммов МВТ с различной лекарственной чувствительностью, выделенных от больных туберкулезом органов дыхания, к 6 основным противотуберкулезным препаратам. Полное совпадение результатов определения лекарственной чувствительности выделенных от больных штаммов МВТ к изониазиду классическим методом и с использованием МТТ-теста было получено в 17 случаях (77,3%), к канамицину — 18 (81,8%), к стрептомицину — 16 (72,7%), к этамбутолу — 12 (54,5%), к этионамиду — 15 (68,2%), к рифампицину — 16 (72,7%). Таким образом, нами было показано значительное совпадение результатов тестирования лекарственной чувствительности штаммов МВТ, выделенных от больных туберкулезом, классическим методом и с использованием МТТ-теста. Необходимо отметить, что колориметрический метод обладает преимуществом – возможностью определения частичной устойчивости штаммов МВТ к противотуберкулезным препаратам, которая имела место в 22,7% случаев при тестировании чувствительности штаммов МВТ к изониазиду, 27,2% — к канамицину, 40,9% — к этамбутолу, 31,8 — к этионамиду, 27,3 — к рифампицину, 22,7% — к стрептомицину.

Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют о высокой точности, воспроизводимости МТТ-теста и возможности использования его в лабораторной практике. Преимуществами разработанного метода являются сокращение сроков исследования, возможность объективной количественной оценки результатов, использование малых количеств исследуемых агентов и питательных сред, поскольку инкубирование культуры микобактерий проводится в малом объеме среды (200 мкл).

Обратите внимание