Реакция цепная полимеразная (ПЦР)

Реакция цепная полимеразная (ПЦР) — процесс получения копий (амплификация) специфических последовательностей ДНК микроорганизмов (бактерий, вирусов, простейших) и/или клеток животных, имеющихся в биологическом материале, в количестве, достаточном для их идентифицикации другими молекулярно-биологическими методами. Метод разработан и впервые использован для диагностики атипичных клеток при анемии в 1985 г. компанией Cetus Corporation (США).

По сути ПЦР является методом клонирования генов. Основными ее компонентами являются:

  • исследуемая ДНК, полученная в соответствии с протоколом (ДНК эстрагируется из бактерий при кипячении культуры микроорганизма в дистиллированной воде);
  • смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ-dATP, dCTP, dGTP, dTTP);
  • термостабильная ДНК-полимераза (Tag-полимераза — 5 ед/мл);
  • олигонуклиотидные праймеры или амплимеры — 20-100 пмоль на реакцию (синтетические отрезки ДНК, комплементарные 3′- и 5′-концам амплифицируемой нуклеотидной последовательности). Праймеры ПЦР имеют размер в 18-25 нуклеотидов, их подбор является ключевым звеном реакции;
  • специальный буфер (10 мМ Трис-HCl рН8.3; 50 мм KCl; 1.5 мМ MgCl2);
  • минеральное масло.

Скорость репликации с помощью ДНК-полимеразы составляет 35-100 нуклеотидов в секунду. ПЦР позволяет в течение нескольких часов многократно увеличить количество копий определенного сегмента ДНК генома.

Постановка ПЦР включает несколько этапов.
1. Приготовление в полистироловых пробирках реакционной смеси следующего состава: а) буфер — 10 мкл; б) смесь дНТФ — 10 мкл;
в) праймеры — до концентрации 0.2-1 мкм;
г) Tag-полимераза — 0.4 мкл (2ЕД); д) ДНК-матрица. На водную фазу наслаивают 1-2 капли минерального масла.

2. Помещение пробирок со смесью реагентов в термоциклер с целью амплификации последних.

Термоциклер позволяет быстро и многократно изменять температуру реакционной смеси. Типичный цикл ПЦР амплификации: начальный прогрев при 94°С в течение 5 минут (25-50 повторов); денатурация исследуемой ДНК (нагрев до 95°С в течение 45 секунд) с образованием одноцепочечных фрагментов, отжиг (снижение температуры до 50°С в течение 45 секунд), во время которого праймеры специфически гибридизируются (присоединяются) к комплементарным последовательностям на противоположных концах двух разъединившихся цепей ДНК так, что их 3′-концы оказываются направленными друг к другу; элонгация (повышение температуры смеси до 72°С в течение 60 секунд), во время которой праймер выступает в качестве своеобразной затравки.

Термостабильная ДНК-полимераза из свободных дНТФ наращивает цепочку ДНК с 3′-конца каждого праймера на нуклеотидной последовательности исследуемой ДНК. Синтез цепи терминируется повышением температуры. В результате синтезируются две новые цепи ДНК (являются точными копиями искомого участка ДНК), которые в свою очередь служат матрицей для связывания присутствующих в реакционной смеси в избытке праймеров и синтеза новых копий в следующем цикле амплификации.

Хорошие результаты дает при амплификация фрагментов генома в 400-2000 нуклеотидов. Конечная продукция составляет 2 xn копий фрагмента (и — число циклов). При этом удается получить концентрацию амплифицированного фрагмента в 106—107. 3. Анализ ПЦР-амплифицированных продуктов (вновь образованные ДНК фрагменты имеют одинаковую молекулярную массу) с помощью трех простых методов: гель-электрофорез, дот-блот-гибридизация, блотгибридизация.

Наиболее широко применяется гель-электрофорез в 2-4% агарозном геле с бромистым этидием одновременно со стандартными фрагментами размером в 50-1000 п.н. Электрофорез проводят при напряжении 1-3 В на 1 см геля в течение 1-3 ч. Амплифицированные ДНК-фрагменты мигрируют в агарозном геле на определенные расстояния от лунки (куда вносился образец), зависящие от их молекулярной массы, и при этом образуются полосы миграции.

Затем гель просматривают в УФ свете на трансиллюминаторе, где хорошо контрастируются полосы миграции амплифицированных ДНК-продуктов и положительных контролей. Электрофореграммы ДНК-продуктов фотографируют.

Интерпретация результатов ПЦР.

В зависимости от того, обнаружена в образце интересующая нас последовательность или нет, результат может быть соответственно положительный или отрицательный. Однако при постановке ПЦР возможны как ложноотрицательные, так и ложноположительные результаты. ПЦР широко используется для диагностики инфекционных заболеваний, иммунодефицитных состояний, идентификации генов патогенности микроорганизмов, генов иммунокомпетентных клеток (иммуноглобулинов, цитокинов, ТКР), обнаружения нуклеиновых кислот бактерий и вирусов в материале, взятом у больных, при генотипировании и таксономии микроорганизмов. Фрагменты амплифицированных нуклеиновых кислот можно использовать для секвенирования генов.

Очистка кожи необходима для здоровья лица. Нет нужды использовать покупные препараты, ведь рецепты скрабов для домашнего изготовления обновляют и восстанавливают кожу ничуть не хуже.

Обратите внимание
Консультация у врача — залог вашего здоровья. Не пренебрегайте личной безопасностью и всегда обращайтесь к доктору вовремя.