Иммуноферментный анализ (столбняк)

См. также “Дифтерия – Иммуноферментный анализ”

При использовании непрямого варианта ИФА специфические антитела, содержащиеся в исследуемом материале, реагируют и образуют комплекс со столбнячным анатоксином, который был предварительно сорбирован на пластиковой поверхности. Затем к образовавшемуся комплексу «антиген—антитело» прикрепляются меченные ферментом антитела к связанным в этом комплексе противостолбнячным антителам (обычно это сыворотки животных против человеческих иммуноглобулинов класса G, т.е. анти-IgG-антитела). Количество связанного фермента, пропорциональное концентрации антител в исследуемой сыворотке, может быть измерено посредством определения интенсивности разрушения ферментом соответствующего субстрата. Обычно субстрат подбирают таким образом, чтобы в результате его взаимодействия с ферментом происходило изменение окраски жидкости; интенсивность этого изменения может быть определена визуально или с помощью фотометра.

В настоящее время ИФА очень широко применяют для определения титров противостолбнячных антител. Для ускоренной оценки интенсивности противостолбнячного иммунитета у людей с различными травмами предложено использовать упрощенную модификацию ИФА.

Были опубликованы сообщения, что у людей, получивших неполный курс прививок, результаты ИФА интерпретировать очень трудно, поскольку определяемые титры противостолбнячных антител не соответствуют результатам реакций in vivo. Вероятно, причиной этого является присутствие в исследуемых сыворотках неспецифических или низкоавидных антител. Частота и выраженность таких противоречий обратно пропорциональна концентрации нейтрализующих антител в исследуемых образцах. Было установлено, что независимо от вакцинального анамнеза минимальные титры противостолбнячных антител в сыворотке крови, «свидетельствующие» о наличии защиты от инфекции, составляют 0,16 МЕ/мл (рис 8)

Рис. 8. Титры противостолбнячных антител, выявленные в 727 сыворотках с помощью ИФА и метода in vivo

Поскольку при использовании непрямого ИФА для количественного определения противостолбнячных антител в человеческих сыворотках с низким содержанием антител отмечаются завышенные результаты, была разработана модификация метода. В основу этого нового варианта, названного «антиген-конкурентным ИФА», положено предположение о том, что связывание антител с антигеном, сорбированным на поверхности лунок микропластинки, отличается от связывания противостолбнячных антител с токсином или анатоксином в растворе. При постановке конкурентного варианта ИФА на первом этапе искомые антитела связываются с известным антигеном в растворе, в результате чего предотвращается их связывание со столбнячным анатоксином, сорбированным на твердой основе. Эту модификацию называют конкурентным ИФА, поскольку
здесь имеет место действительная конкуренция между свободным анатоксином, содержащимся в растворе, и связанным анатоксином, сорбированным на нерастворимом носителе (твердой основе). Результаты конкурентного ИФА коррелируют с результатами реакции нейтрализации in vitro.

Реакция угнетения связывания токсина (РУСТ) — еще одна модификация ИФА. Столбнячный токсин предварительно инкубируют с различными разведениями исследуемой сыворотки, а затем эти смеси вносят в лунки пластинок, покрытые противостолбнячными антителами. РУСТ основана на выявлении несвязавшегося токсина в смеси «токсин—антитела» и по своему принципу сходна с реакцией нейтрализации. Различие между этими двумя методами состоит в способе, с помощью которого выявляют свободный токсин: при постановке РУСТ токсин определяют с помощью специфических антител, меченных ферментом, тогда как при постановке реакции нейтрализации регистрируют непосредственно токсический эффект на мышах.

При постановке РУСТ отмечается более высокая корреляция результатов с результатами методов in vivo, чем при использовании стандартного ИФА. Однако материалы по использованию конкурентного ИФА и РУСТ для определения противостолбнячных антител пока немногочисленны. Необходимы дополнительные данные о результатах сравнительного изучения этих методов и реакции нейтрализации, особенно — в отношение сывороток с низкой концентрацией противостолбнячных антител.

Обратите внимание